The heterologous expression of Escherichia coli MutT enzyme is involved in the protection against oxidative stress in Leishmania braziliensis

BACKGROUND Oxidative stress is responsible for generating DNA lesions and the 8-oxoguanine (8-oxoG) is the most commonly lesion found in DNA damage. When this base is incorporated during DNA replication, it could generate double-strand DNA breaks and cellular death. MutT enzyme hydrolyzes the 8-oxoG from the nucleotide pool, preventing its incorporation during DNA replication. OBJECTIVES To investigate the importance of 8-oxoG in Leishmania infantum and L. braziliensis, in this study we analysed the impact of heterologous expression of Escherichia coli MutT (EcMutT) enzyme in drug-resistance phenotype and defense against oxidative stress. METHODS Comparative analysis of L. braziliensis and L. infantum H2O2 tolerance and cell cycle profile were performed. Lines of L. braziliensis and L. infantum expressing EcMutT were generated and evaluated using susceptibility tests to H2O2 and SbIII, cell cycle analysis, γH2A western blotting, and BrdU native detection assay. FINDINGS Comparative analysis of tolerance to oxidative stress generated by H2O2 showed that L. infantum is more tolerant to exogenous H2O2 than L. braziliensis. In addition, cell cycle analysis showed that L. infantum, after treatment with H2O2, remains in G1 phase, returning to its normal growth rate after 72 h. In contrast, after treatment with H2O2, L. braziliensis parasites continue to move to the next stages of the cell cycle. Expression of the E. coli MutT gene in L. braziliensis and L. infantum does not interfere in parasite growth or in susceptibility to SbIII. Interestingly, we observed that L. braziliensis EcMutT-expressing clones were more tolerant to H2O2 treatment, presented lower activation of γH2A, a biomarker of genotoxic stress, and lower replication stress than its parental non-transfected parasites. In contrast, the EcMutT is not involved in protection against oxidative stress generated by H2O2 in L. infantum. MAIN CONCLUSIONS Our results showed that 8-oxoG clearance in L. braziliensis is important to avoid misincorporation during DNA replication after oxidative stress generated by H2O2.

Ascorbate peroxidase overexpression protects Leishmania braziliensis against trivalent antimony effects

Ascorbate peroxidase (APX) is a redox enzyme of the trypanothione pathway that converts hydrogen peroxide (H2O2) into water molecules. In the present study, the APX gene was overexpressed in Leishmania braziliensis to investigate its contribution to the trivalent antimony (SbIII)-resistance phenotype. Western blot results demonstrated that APX-overexpressing parasites had higher APX protein levels in comparison with the wild-type line (LbWTS). APX-overexpressing clones showed an 8-fold increase in the antimony-resistance index over the parental line. In addition, our results indicated that these clones were approximately 1.8-fold more tolerant to H2O2 than the LbWTS line, suggesting that the APX enzyme plays an important role in the defence against oxidative stress. Susceptibility tests revealed that APX-overexpressing L. braziliensis lines were more resistant to isoniazid, an antibacterial agent that interacts with APX. Interestingly, this compound enhanced the anti-leishmanial SbIII effect, indicating that this combination represents a good strategy for leishmaniasis chemotherapy. Our data demonstrate that APX enzyme is involved in the development of L. braziliensis antimony-resistance phenotype and may be an attractive therapeutic target in the design of new strategies for leishmaniasis treatment.

Efeito da 1, 10-fenantrolina e seus derivados complexados em metal na atividade proteolítica de Leishmania braziliensis / Effect of 1, 10-phenanthroline and its complexed metal derivatives in proteolytic activity of Leishmania braziliensis

Leishmanioses são um grupo de doenças com um largo espectro de manifestações clínicas, as quais variam desde lesões cutâneas até o envolvimento visceral severo, podendo levar ao ótibo. A leishmaniose é, ainda hoje, uma doença negligenciada, estando entre os agravos prioritários do programa de pesquisa sobre doenças da pobreza da Organização Mundial da Saúde (OMS). Além de não haver vacinas disponíveis, a terapia é baseada em medicamentos injetáveis que causam sérios efeitos colaterais, tornando o tratamento inviável para muitos países endêmicos. Drogas derivadas de metal representam um novo arsenal terapêutico antimicrobiano e anti-câncer. Os inibidores de peptidase/agentes quelantes tais como 1,10-fenantrolina e seus derivados, no estado livre de metal ou como ligantes com metais de transição, interferem com a função de vários sistemas biológicos. Em trabalhos anteriores, nosso grupo descreveu que o parasito L. braziliensis produziu moléculas gp63 sensíveis a 1,10-fenantrolina. No presente trabalho, demonstramos a distribuição celular da molécula gp63 em uma cepa virulenta de L. braziliensis por meio de análises bioquímicas e imuno-histoquímica. Depois disso, relatamos os efeitos inibitórios de três compostos derivados da 1,10-fenantrolina, 1,10-fenantrolina-5,6-dioma (phendio), [Cu(phendio)2] e [Ag(phendio)2], nas atividades metalopeptidases celulares e extracelulares produzidas por promastigotas de L. braziliensis, bem como as suas ações sobre a viabilidade do parasita e na interação com as células de macrófagos murinos. As moléculas gp63 foram detectadas em compartimentos de parasitos, incluindo membrana citoplasmatica e bolsa flagelar. O tratamento de promastigotas de L. braziliensis durante 1 hora com 1,10-fenantrolina e seus derivados resultou numa inibição significativa da viabilidade celular e mostrou um mecanismo de ação irreversível. Estes inibidores de metalopeptidases induziram apoptose em promastigotas de L. braziliensis, demonstrada através ...

Leishmaniasis is a group of diseases with a wide spectrum of clinical manifestations, which range from self-limited skin lesions to severe visceral involvement that can lead to death. Leishmaniasis is still a neglected disease, and it is among the priorities of the research program on diseases of poverty of World Health Organization (TDR/WHO). There is no available vaccine and the treatment is based on drugs that cause serious side effects, and are unaffordable in several endemic countries. Metal-based drugs represent a novel antimicrobial and anti-cancer therapeutics arsenal. Peptidase inhibitors/chelating agents such as 1,10-phenanthroline and its substituted derivatives, either the metal-free state or as ligands coordinated to transition metals, interfere with crucial functions of several biological systems. In previous works, our group described that L. braziliensis produced gp63 molecules sensible to 1,10-phenanthroline. Herein, we initially studied the cellular distribution of gp63 in a virulent strain of L. braziliensis by biochemical and immunocytochemical analyses. After that, we reported the inhibitory effects of three 1,10-phenanthroline derivative compounds, 1,10-phenanthroloine-5,6-dione (phendio), [Cu(phendio)2] and [Ag(phendio)2], on both cellular and extracellular metallopeptidase activities produced by L. braziliensis promastigotes as well as their actions on the parasite viability and on the interaction with murine macrophage cells. The gp63 molecules were detected in several parasite compartments, including cytoplasm, membrane lining the cell body and flagellum, and flagellar pocket. The treatment of L. braziliensis promastigotes for 1 hour with 1,10-phenanthroline and its derivatives resulted in a significant inhibition of cell viability and showed an irreversible mechanism of action. These metallopeptidase inhibitors induced apoptosis in L. braziliensis promastigotes as judged by annexin/propidium iodide staining and TUNEL assays ...

Estudo da variabilidade genética de Leishmania (Viannia) braziliensis Vianna, 1911 de diferentes regiões do Brasil

Leishmania (Viannia) braziliensis é a espécie mais prevalente nos casos humanos da leishmaniose tegumentar nas Américas. Polimorfismo genético têm sido encontrado em populações naturais de diferentes espécies de Leishmania, o que explicaria a adaptação destes parasitos às mudanças observadas nas condições ambientais. Neste estudo utilizou-se um painel significativo de isolados L. braziliensis de focos de LTA de diferentes regiões geográficas e biomas do Brasil. Os polimorfismos do DNA genômico foram analisados utilizando-se diferentes marcadores genéticos, comparou-se a variabilidade genética intra-específica das amostras e determinou-se as relações fenéticas entre elas. Na eletroforese de isoenzimas (MLEE), a maioria das amostras (87,3%) apresentou o perfil de migração idêntico ao da cepa padrão de L. braziliensis (M2903); 8 amostras (10,2%) apresentaram apenas um eletromorfo diferente para a enzima IDHNADP. Duas amostras (2,6%) apresentaram o perfil mais heterogêneo, com padrões diferentes de L. braziliensis para 3 enzimas (G6PDH, IDHNADP e MDH). Estas amostras foram designadas como variantes. Para o RAPD-PCR com o iniciador M1340F pode-se observar que o conjunto dos isolados formaram claramente dois grandes clusters, pela análise com o programa NTSYS, refletindo a diversidade genética entre as amostras de L. braziliensis testadas. A análise dos perfis gerados pela SSR-PCR evidenciou que os iniciadores CARY e K7 foram capazes de mostrar variabilidade intra-específica. Observou-se que com o iniciador CARY, as amostras agruparam-se em um clustrer, incluindo a cepa de referência de L. braziliensis. Por outro lado, com o iniciador K7 observou-se a formação de dois clusters.

Uma árvore consenso foi gerada por parcimônia com os dados concatenados dos três marcadores utilizados (M1340F, CARY e K7) e observou-se a formação de dois clusters onde a maioria das amostras do bioma Amazônia /região Norte (58%) e região Nordeste (62%) estão juntas em um grupo e o bioma Cerrado /região Centro-Oeste (100%), Cerrado e Mata Atlântica (67%) e a região Sul (80%) estão em outro grupo, o que concorda com a análise feita pelo método de distância genética. Foram encontrados dois perfis para ITS1- HAEIII e após a análise dos géis foram identificados três perfis para hsp70-BstUI. Observou-se que o índice de similaridade médio entre as amostras para os testes de isoenzimas, RAPD-PCR com o iniciador M1340, SSR-PCR com o iniciador CARYe K7 foi de aproximadamente 70%, demonstrando a existência de variabilidade de L. braziliensis confirmada através das diferentes técnicas utilizadas. Combinando os resultados da análise por biomas e por região, podemos dizer que a maioria das amostras do bioma Amazonas, região Norte e bioma Caatinga estão sempre agrupadas em um mesmo clustere o bioma Cerrado, região centro-oeste em outro cluster. Este estudo refletiu a diversidade genética existente em L. braziliensis sugerindo a possibilidade de uma associação entre variabilidade e origem geográfica

Estudo da variabilidade genética de Leishmania (Viannia) braziliensis Vianna, 1911 de diferentes regiões do Brasil / Study of genetic variability of Leishmania (Viannia) braziliensis Vianna, 1911 from different regions of Brazil

Leishmania (Viannia) braziliensis é a espécie mais prevalente nos casos humanos da leishmaniose tegumentar nas Américas. Polimorfismo genético têm sido encontrado em populações naturais de diferentes espécies de Leishmania, o que explicaria a adaptação destes parasitos às mudanças observadas nas condições ambientais. Neste estudo utilizou-se um painel significativo de isolados L. braziliensis de focos de LTA de diferentes regiões geográficas e biomas do Brasil. Os polimorfismos do DNA genômico foram analisados utilizando-se diferentes marcadores genéticos, comparou-se a variabilidade genética intra-específica das amostras e determinou-se as relações fenéticas entre elas. Na eletroforese de isoenzimas (MLEE), a maioria das amostras (87,3%) apresentou o perfil de migração idêntico ao da cepa padrão de L. braziliensis (M2903); 8 amostras (10,2%) apresentaram apenas um eletromorfo diferente para a enzima IDHNADP. Duas amostras (2,6%) apresentaram o perfil mais heterogêneo, com padrões diferentes de L. braziliensis para 3 enzimas (G6PDH, IDHNADP e MDH). Estas amostras foram designadas como variantes. Para o RAPD-PCR com o iniciador M1340F pode-se observar que o conjunto dos isolados formaram claramente dois grandes clusters, pela análise com o programa NTSYS, refletindo a diversidade genética entre as amostras de L. braziliensis testadas. A análise dos perfis gerados pela SSR-PCR evidenciou que os iniciadores CARY e K7 foram capazes de mostrar variabilidade intra-específica. Observou-se que com o iniciador CARY, as amostras agruparam-se em um clustrer, incluindo a cepa de referência de L. braziliensis. Por outro lado, com o iniciador K7 observou-se a formação de dois clusters.

Uma árvore consenso foi gerada por parcimônia com os dados concatenados dos três marcadores utilizados (M1340F, CARY e K7) e observou-se a formação de dois clusters onde a maioria das amostras do bioma Amazônia /região Norte (58%) e região Nordeste (62%) estão juntas em um grupo e o bioma Cerrado /região Centro-Oeste (100%), Cerrado e Mata Atlântica (67%) e a região Sul (80%) estão em outro grupo, o que concorda com a análise feita pelo método de distância genética. Foram encontrados dois perfis para ITS1- HAEIII e após a análise dos géis foram identificados três perfis para hsp70-BstUI. Observou-se que o índice de similaridade médio entre as amostras para os testes de isoenzimas, RAPD-PCR com o iniciador M1340, SSR-PCR com o iniciador CARYe K7 foi de aproximadamente 70%, demonstrando a existência de variabilidade de L. braziliensis confirmada através das diferentes técnicas utilizadas. Combinando os resultados da análise por biomas e por região, podemos dizer que a maioria das amostras do bioma Amazonas, região Norte e bioma Caatinga estão sempre agrupadas em um mesmo clustere o bioma Cerrado, região centro-oeste em outro cluster. Este estudo refletiu a diversidade genética existente em L. braziliensis sugerindo a possibilidade de uma associação entre variabilidade e origem geográfica

Isolation and isoenzyme characterization of Leishmania (Viannia) braziliensis from a case of human cutaneous leishmaniasis in northeast centre of the state of São Paulo

The diagnosis of human cutaneous leishmaniasis in small towns is sometimes made without the species identification of the Leishmania, even in areas without previous epidemiological surveys. Here we report the isolation of a Leishmania strain from a patient of Rincão, state of São Paulo, that was identified by isoenzyme characterization as L. (Viannia) braziliensis. Sand fly collections were made in the area where the patient live in order to investigate the likely vector species.

Heterogeneity of cysteine proteinases in Leishmania braziliensis and Leishmania major

Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) with acrylamide copolymerized with gelatin (substrate-SDS-PAGE) was used to compare promastigote proteinases from two Leishmania species (L. braziliensis and L. major-like). Substrate-SDS-PAGE resolved at least 6 distinct proteinase activities with relative molecular masses between 20 and 65 kDa. The profile of proteinase activity was the same for both species, although qualitative differences were observed. L. major-like expressed a low molecular weight (20 kDa) proteinase with maximum activity at pH 7.0, which was demonstrable from pH 5.0 to pH 8.0. The 20-kDa protease was recovered in the detergent phase of TX-114 and was inhibited by the sulfhydryl group-blocking reagent E-64 (2.5 mM) and the non-specific inhibitor iodoacetic acid (1 mM). Pepstatin (1 microM) and PMSF (2.5 mM) did not inhibit the 20-kDa enzyme. The present study suggests that both Leishmania species studied express hydrophobic cysteine proteases of different molecular weights, since about 2 x 10(7) parasites were analyzed in each lane and the proteolytic activity developed at 37 degrees C for 16 h